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?熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書

日期:2024/5/16瀏覽:606次

熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書

產(chǎn)品及特點熒光假單胞菌是一種環(huán)境污染菌。對于人類是一種罕見的機(jī)會致病菌??蓮膫?、痰、胸水、尿和血液中分離出來,也可從血庫存在中分離出??稍诒鋬Υ娴难杭把褐破分蟹敝常易匀芎筢尫艃?nèi)毒素。其內(nèi)毒素的磷脂部分,可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克。因此快速靈敏檢測熒光假單胞菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,它具有下列特點:

1.即開即用,用戶只需要提供 DNA 模板。

2.引物經(jīng)過精心優(yōu)化,專一性強(qiáng),只擴(kuò)增熒光假單胞菌,與其他微生物沒有交叉反應(yīng)。

3.提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。

4.PCR mix 中含上樣染料,PCR 后可以直接上樣電泳。

1.本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次,但只能用于科研。


規(guī)格及成分成分 包裝

2×Probe qPCR MagicMix500μL

熒光 PCR 專用模板稀釋液1mL

熒光假單胞菌探針法 qPCR

引物-探針混合液150μL

熒光假單胞菌探針法 qPCR 陽性

對照(1×10E7 拷貝/μL)50μL

使用手冊1 份

運(yùn)輸及保存低溫運(yùn)輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法一、稀釋PCR 陽性對照(以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)

如果做定性實驗,則此步可以跳過。如果做定量實驗,則需要稀釋陽性對照做標(biāo)準(zhǔn)曲線。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,     只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.標(biāo)記 6 個離心管,分別為 6,5,4,3,2,1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液(最好用帶芯槍頭,下同)。

3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,


得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭,在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭,在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品,必須設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是樣品制備 PC(樣品制備陽性對照),一個是樣品制備 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。三、Probe qPCR 反應(yīng)(20μL 體系,在樣品制備室進(jìn)行)

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管中的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為描述操作步驟,

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

11.蓋上蓋子后上機(jī),按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR:


過程溫度時間

預(yù)變性95℃2min

qPCR 反應(yīng)

(40 個循環(huán))95℃15sec

55℃30sec(采集 FAM 通道的熒光信號)

72℃30sec

四、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴(kuò)增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品, 如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,

則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 40,則為陽性。

 產(chǎn)品CAT#:BH5216-51

低溫運(yùn)輸,-20℃保存


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